Spektrofotometrie je experimentální technika používaná k měření koncentrace rozpuštěné látky v konkrétním roztoku výpočtem množství světla absorbovaného touto látkou. Tato technika je velmi užitečná, protože určité sloučeniny budou také absorbovat různé vlnové délky světla s různou intenzitou. Analýzou světla procházejícího roztokem můžete identifikovat sloučeniny rozpuštěné v roztoku a jejich koncentrace. Nástroj používaný k laboratorní analýze roztoků touto technikou je spektrofotometr.
Krok
Část 1 ze 3: Příprava vzorku
Krok 1. Zapněte spektrofotometr
Většinu spektrofotometrů je třeba před přesným měřením zahřát. Před měřením vzorku tedy spusťte zařízení a nechte jej alespoň 15 minut sedět.
Tento čas použijte k přípravě vzorku
Krok 2. Vyčistěte kyvetu nebo zkumavku
Ve školních laboratořích mohou být k dispozici jednorázové zkumavky, které není nutné nejprve čistit. Pokud však používáte běžnou kyvetu nebo zkumavku, nezapomeňte před použitím přístroj důkladně vyčistit. Opláchněte všechny kyvety deionizovanou vodou.
- Buďte opatrní při používání kyvet, protože jsou poměrně drahé.
- Při používání kyvety se nedotýkejte strany, kde prochází světlo (obvykle čirá strana nádoby).
Krok 3. Nalijte dostatečné množství vzorku do kyvety
Maximální objem části kyvety je 1 ml, zatímco maximální objem zkumavky je 5 ml. Vaše měření by mělo být přesné, pokud světlo spektrofotometru může stále procházet vzorkem a ne prázdnou částí nádoby.
Pokud k vkládání vzorků používáte pipetu, použijte pro každý vzorek nový hrot. Tímto způsobem lze zabránit křížové kontaminaci
Krok 4. Připravte kontrolní roztok
Tyto roztoky, které jsou také známé jako polotovary nebo polotovary, obsahují pouze rozpouštědlo v analyzovaném roztoku. Pokud máte například vzorek soli rozpuštěný ve vodě, slepý roztok, který potřebujete, je voda. Pokud je voda, kterou používáte, červená, měli byste také použít červený slepý roztok. Pomocí podobného kontejneru držte slepý roztok ve stejném objemu jako vzorek.
Krok 5. Otřete vnější část kyvety
Před vložením kyvety do spektrofotometru se musíte ujistit, že je čistá, aby nedošlo k interferenci s měřením v důsledku prachových částic nebo nečistot. Pomocí hadříku nepouštějícího vlákna odstraňte kapky vody nebo prach ulpívající na vnější straně kyvety.
Část 2 ze 3: Experimentování
Krok 1. Určete a upravte vlnovou délku světla pro analýzu vzorku
Ke zvýšení účinnosti měření použijte jedinou vlnovou délku světla (monochromatický paprsek). Vyberte barvu světla, které může být absorbováno chemickým obsahem, o kterém se předpokládá, že je ve zkušebním vzorku rozpuštěn. Nastavte vlnovou délku podle specifikací spektrofotometru, který používáte.
- Ve školních laboratořích budou tyto vlnové délky obvykle uvedeny v experimentálních pokynech.
- Protože vzorek bude odrážet veškeré viditelné světlo, vlnová délka barvy experimentálního světla se obvykle vždy liší od barvy vzorku.
- Objekt má určitou barvu, protože odráží určitou vlnovou délku a absorbuje všechny ostatní barvy. Tráva vypadá zelená, protože chlorofyl v ní odráží zelenou a pohlcuje jiné barvy.
Krok 2. Kalibrujte spektrofotometr slepým roztokem
Umístěte slepý roztok do kyvetového držáku a zavřete spektrofotometr. Na obrazovce analogového spektrofotometru je jehla, která se bude pohybovat na základě intenzity detekce světla. Po vložení slepého roztoku by se jehla měla posunout doprava. Zaznamenejte si tuto hodnotu pro případ, že ji budete později potřebovat. Nechte slepý roztok zůstat ve spektrofotometru, poté posuňte jehlu na nulu pomocí nastavovacího knoflíku.
- Stejným způsobem lze také kalibrovat digitální spektrofotometry. Tento nástroj je však vybaven digitální obrazovkou. Pomocí ovládacího knoflíku nastavte hodnotu slepého roztoku na 0.
- I když je slepý roztok odstraněn ze spektrofotometru, kalibrace bude stále platná. Když tedy změříte celý vzorek, absorbance blanku se automaticky sníží.
Krok 3. Odstraňte slepý pokus a otestujte výsledky kalibrace spektrofotometru
I po vyjmutí slepého roztoku ze spektrofotometru by měla jehla nebo číslo na obrazovce stále ukazovat 0. Vložte slepý roztok zpět do spektrofotometru a ujistěte se, že se hodnoty nemění. Pokud je spektrofotometr správně kalibrován pomocí slepého roztoku, výsledek na obrazovce by měl být stále 0.
- Pokud jehla nebo číslo na obrazovce neuvádí 0, opakujte kroky kalibrace s prázdným roztokem.
- Pokud problém přetrvává, vyhledejte pomoc nebo nechte někoho zkontrolovat spektrofotometr.
Krok 4. Změřte absorbanci vzorku
Odstraňte slepý roztok a vložte vzorek do spektrofotometru. Počkejte asi 10 sekund, než se ruce stabilizují nebo se čísla na digitálním displeji přestanou měnit. Zaznamenejte procento propustnosti a/nebo absorbance vzorku.
- Čím více světla projde, tím méně světla pohltí. Obvykle je třeba zaznamenat hodnotu absorbance vzorku, která je obecně vyjádřena jako desetinné číslo, například 0,43.
- Měření každého vzorku opakujte alespoň třikrát a poté vypočítejte průměr. Díky tomu budou výsledky, které získáte, přesnější.
Krok 5. Opakujte experiment s různými vlnovými délkami světla
Váš vzorek může obsahovat několik sloučenin, které mají různé absorbance v závislosti na vlnové délce světla. Ke snížení nejistoty opakujte měření vzorku v intervalech vlnových délek 25 nm napříč světelným spektrem. Tímto způsobem můžete detekovat další rozpuštěné chemikálie ve vzorku.
Část 3 ze 3: Analýza údajů o absorbci
Krok 1. Vypočítejte propustnost a absorbanci vzorku
Propustnost udává, kolik světla může projít vzorkem a dosáhnout spektrofotometru. Mezitím je absorbance to, kolik světla absorbuje jedna z rozpuštěných chemikálií ve vzorku. Existuje mnoho moderních spektrofotometrů poskytujících výstup ve formě propustnosti a absorbance. Pokud však získáte hodnotu intenzity světla, můžete si tyto dvě hodnoty vypočítat také sami.
- Propustnost (T) lze určit vydělením intenzity světla procházejícího roztokem vzorku množstvím světla procházejícího slepým roztokem. Tato hodnota je obvykle vyjádřena jako desetinné číslo nebo procento. T = I/I0, kde I je intenzita vzorku a I0 je prázdná intenzita.
- Absorbance (A) je vyjádřena jako záporná báze 10 logaritmů (exponent) transmitance: A = -log10T. Pokud tedy T = 0, 1, A = 1 (0, 1 je 10 až mocnina -1). To znamená, že projde 10% světla, zatímco 90% je absorbováno. Mezitím, pokud T = 0,01, A = 2 (0,01 je 10 k síle -2). To znamená, že světlo, které prochází, je 0,1%.
Krok 2. Grafy absorbance hodnoty vs. vlnové délky
Hodnotu absorbance vyjádřete jako osu y a vlnovou délku jako osu x. Z bodů všech výsledků absorbance v každé vlnové délce získáte spektrum absorbance vzorku a identifikujete obsah sloučeniny a její poměr ve vzorku.
Absorpční spektra mají obvykle píky na určitých vlnových délkách. Tyto špičkové vlnové délky vám umožňují identifikovat konkrétní sloučeniny
Krok 3. Porovnejte své absorbční spektrum s grafem známé sloučeniny
Každá sloučenina má jedinečné spektrum absorbance a při každém měření má vždy stejnou špičkovou vlnovou délku. Porovnáním grafu, který získáte s grafem určité známé sloučeniny, můžete identifikovat obsah rozpuštěné látky v roztoku vzorku.
