Gramové barvení je rychlá technika a používá se ke zjištění přítomnosti bakterií ve vzorku tkáně a ke klasifikaci bakterií jako grampozitivní nebo gramnegativní na základě chemických a fyzikálních vlastností jejich buněčných stěn. Gramovo barvení se téměř vždy používá jako první krok při diagnostice bakteriální infekce.
Tato technika barvení je pojmenována po dánském vědci Hansi Christianu Gramovi (1853 - 1938), který tuto techniku vyvinul v roce 1882 a v roce 1884 ji publikoval jako techniku pro rozlišení dvou typů bakterií s podobnými klinickými příznaky: Streptococcus pneumoniae (také známý jako Streptococcus pneumoniae). Pneumokoky) a bakterie Klebsiella pneumoniae.
Krok
Metoda 1 ze 3: Příprava mikroskopického sklíčka
Krok 1. Připravte se na práci v laboratoři
Abyste zabránili bakteriální kontaminaci vzorku, který testujete, noste rukavice a kravatu s dlouhými vlasy. Vyčistěte pracovní prostor pod digestoří nebo na jiném dobře větraném místě. Před spuštěním zkontrolujte Bunsenův hořák a ujistěte se, že mikroskop funguje správně.
Krok 2. Sterilizujte sklíčko mikroskopu
Pokud je sklíčko znečištěné, omyjte jej mýdlovou vodou, abyste odstranili olej a nečistoty. Sklíčka očistěte ethanolem, čističem skla nebo jinou metodou, kterou používá vaše laboratoř.
Krok 3. Umístěte vzorek na skleněné podložní sklíčko
Pomocí techniky Gramova barvení můžete pomoci identifikovat bakterie ve zdravotnickém vzorku nebo kulturu bakterií rostoucích v Petriho misce. Nejlepších výsledků dosáhnete použitím Gramových skvrn na tenké tahy vzorku. Doporučuje se použít vzorky mladší než 24 hodin, protože starší bakterie mohly poškodit jejich buněčné stěny a nemusí reagovat na Gramovo barvení.
- Pokud používáte vzorek tkáně, přidejte 1–2 kapky na skleněné podložní sklíčko. Rovnoměrně rozetřete na podložní sklíčko a vytvořte tenkou vrstvu postřiku vzorků tak, že jej posunete okrajem druhého sterilního skleněného sklíčka. Před dalším krokem nechte zaschnout.
- Pokud odebíráte bakterie z Petriho misky, sterilizujte očkovací smyčku v Bunsenově hořáku, dokud nezáří, poté ji nechte vychladnout. Pomocí smyčky nakapejte sterilní vodu na podložní sklíčko, poté sterilizujte a znovu ochlaďte, než jej použijete k odběru malého vzorku bakterií. Poté jemně promíchejte.
- Bakterie připravené v bujónu musí být znovu promíchány pomocí vortexu, poté odebrány očkovací smyčkou, jak je uvedeno výše, bez přidání vody.
- Pokud máte vzorek tamponu (obvykle se provádí pomocí malé rukojeti s bavlněnou špičkou), dotkněte se ho a jemně otočte tamponem přes podložní sklíčko.
Krok 4. Mírně vysoká teplota může udělat dobrý nátěr
Teplo drží bakterie na povrchu sklíčka, takže se během procesu barvení nerozpustí snadno. Rychle dvakrát až třikrát klepněte na sklíčko nad Bunsenovým hořákem nebo ohřejte sklíčko přes elektrický ohřívač diapozitivů. Nepřehřívejte, může dojít k poškození vzorku. Pokud používáte Bunsenův hořák, měl by to být malý, ale modrý plamen místo velkého oranžového plamene.
Alternativně lze nátěr provést také s methanolem, a to přidáním 1–2 kapek methanolu do suchého nátěru, přičemž se zbývající methanol na podložním skle vysuší ponecháním na čerstvém vzduchu. Tato technika minimalizuje poškození buněk a poskytuje čisté pozadí snímku
Krok 5. Umístěte sklíčko nad barvicí podnos
Barvící misky jsou vyrobeny z kovu, skla nebo mělkých plastových desek s měkkou síťovinou lemující horní část. Umístěte sklíčka na horní část těchto sítí, aby kapalina, kterou používáte, mohla být vypuštěna do zásobníku.
Pokud nemáte zásobník na barvení, můžete na plastový zásobník umístit sklíčko pro tisk kostek ledu
Metoda 2 ze 3: Gramovo barvení
Krok 1. Nalijte krystalově fialovou tekutinu na nátěr
Pomocí pipety nastříkejte vzorek bakterií několika kapkami krystalově fialového barviva, známého také jako hořec fialový. Nechte to 30-60 sekund. Krystalová fialka (KV) se ve vodném roztoku oddělí na ionty KV+ a chlorid (Cl-). Tyto ionty pronikají do buněčných stěn a buněčných membrán grampozitivních i gramnegativních bakterií. Ion KV+ interaguje s negativně nabitými složkami bakteriálních buněk, což dává buňkám purpurovou barvu.
Mnoho laboratoří používá krystalovou fialku „Hucker“, která obsahuje šťavelan amonný, aby se zabránilo srážení
Krok 2. Krystalovou fialku jemně opláchněte
Nakloňte sklíčko a pomocí lahve s ostřikovačem na sklíčko nastříkejte malý proud destilované nebo kohoutkové vody. Voda by měla stékat po povrchu nátěru a neměla by být stříkána přímo na nátěr. Neoplachujte nadměrně. Může odstranit barvení grampozitivních bakterií.
Krok 3. Rozetřete nátěr jódem a poté opláchněte
Pomocí kapátka propláchněte nátěr jódem. Nechte působit alespoň 60 sekund, poté pečlivě opláchněte stejným způsobem jako výše. Jód, ve formě záporně nabitého iontu, interaguje s KV+ za vzniku velkého komplexu sloučenin mezi krystalovou fialkou a jodem (komplex sloučenin CV-I) ve vnitřní a vnější vrstvě buňky. Tento komplex sloučenin si zachová fialovou barvu krystalové fialky uvnitř buňky, na obarvených místech.
Jód je žíravá látka. Zabraňte vdechnutí, požití nebo kontaktu s kůží
Krok 4. Přidejte barevné bělidlo a poté rychle opláchněte
K tomuto důležitému kroku se obvykle používá směs acetonu a ethanolu v poměru 1: 1, kterou je třeba pečlivě načasovat. Umístěte sklíčko pod určitý úhel a poté přidejte barevné bělidlo, dokud již ve vodě používané k oplachování není vidět žádný purpur. To obvykle trvá méně než 10 sekund, nebo dokonce kratší dobu, pokud bělidlo obsahuje vysokou koncentraci acetonu. Tento krok okamžitě zastavte, jinak barvivo také vyluhuje krystalovou fialku z grampozitivních a negativních buněk a postup barvení je nutné opakovat. Přebytečné bělidlo okamžitě opláchněte předchozí technikou.
- Jako náhradu lze použít čistý aceton (95%+). Čím více acetonu použijete, tím rychleji bude bělidlo fungovat, takže je třeba věnovat více pozornosti načasování.
- Pokud máte potíže se sledováním času pro tento krok, přidejte barvivo bělidlo po kapkách.
Krok 5. Posypte barvivo proti barvivu a poté opláchněte
Counter barvení, obvykle safranin nebo fuchsin, se používá ke zvýšení kontrastu mezi gramnegativními a grampozitivními bakteriemi barvením odbarvených (odbarvených) bakterií, tj. Gramnegativních bakterií, růžově nebo červeně. Nechte působit alespoň 45 sekund, poté opláchněte.
Fuchsin bude intenzivně barvit mnoho gramnegativních bakterií, jako jsou Haemophilus spp a Legionella spp. Tato metoda je vhodná pro začátečníky
Krok 6. Vysušte sklíčko
Můžete je sušit na čerstvém vzduchu, abyste je vysušili, nebo je můžete vysušit pomocí báječného papíru prodaného k tomuto účelu. Proces barvení podle gramů je dokončen.
Metoda 3 ze 3: Kontrola výsledků barvení
Krok 1. Připravte si světelný mikroskop
Umístěte sklíčko pod mikroskop. Bakterie se velmi liší velikostí, takže celkové požadované zvětšení se bude pohybovat od 400x do 1000x. Pro ostřejší obraz se doporučuje použít objektiv s imerzním olejem. Nalijte na sklíčko imerzní olej, vyhýbejte se pohybu a kapejte, aby se nevytvořily bubliny. Přesuňte rukojeť čočky mikroskopu tak, aby čočka objektivu zapadla na místo a dotkla se oleje.
Olejovou imerzi lze použít pouze na speciálně navržených čočkách, nikoli na „suchých“čočkách
Krok 2. Pokuste se identifikovat grampozitivní a gramnegativní bakterie
Prohlédněte podložní sklíčko pod světelným mikroskopem. Grampozitivní bakterie mají purpurovou barvu, protože krystalově fialová je zachycena v tlusté buněčné stěně. Gramnegativní bakterie budou mít růžovou nebo červenou barvu, protože krystalová fialka se vypláchne tenkými buněčnými stěnami, kam vstoupí růžové protibarvivo.
- Pokud je vzorek příliš silný, může být výsledek falešně pozitivní. Pokud se na vzorku objeví všechny grampozitivní bakterie, obarvěte, abyste se ujistili, že výsledek je správný.
- Pokud použijete příliš mnoho barevného bělidla, může být výsledek falešně negativní. Pokud vzorek ukazuje všechny gramnegativní bakterie, obarvěte, abyste se ujistili, že výsledek je správný.
Krok 3. Porovnejte výsledky, které vidíte, s referenčním obrázkem
Pokud nevíte, jak bakterie vypadají, prostudujte si sbírku referenčních obrázků, obvykle seřazených podle tvaru a Gramových skvrn. Online databáze si také můžete prohlédnout na [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos, and many other online sites. Pro usnadnění identifikace jsou níže uvedeny příklady bakterií, se kterými se běžně setkáváme nebo jsou důležité pro diagnostiku, klasifikované podle jejich gramového stavu a tvaru.
Krok 4. Identifikujte grampozitivní bakterie podle jejich tvaru
Bakterie jsou dále klasifikovány podle tvaru pod mikroskopem, nejčastěji jako koky (sférické) nebo tyčinky (válcovité). Zde je několik příkladů grampozitivních bakterií (purpurové barvy) podle jejich tvaru:
- Grampozitivní koky obvykle stafylokoky (což znamená skupinové koky) nebo streptokoky (což znamená řetězové koky).
- Grampozitivní tyčinky jako Bacillus, Clostridium, Corynebacterium a Listeria. Tyčinkové bakterie Actinomyces spp. obvykle mají větve nebo vlákna.
Krok 5. Identifikujte gramnegativní bakterie
Gramnegativní bakterie (růžové barvy) jsou často klasifikovány do tří skupin. Cocci jsou kulovitého tvaru, tyčinky jsou dlouhé a tenké, zatímco cocoidové tyčinky jsou mezi nimi.
- Gram negativní koky Nejběžnější je Neisseria spp.
- Gramnegativní tyčinky např. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas a mnoho dalších. Vibrio cholerae lze vidět jako pravidelný nebo ohnutý stonek.
- Gramnegativní tyčinkové bakterie „coccoid“(nebo „coccobacilli“) např. Bordetella, Brucella, Haemophilus a Pasteurella
Krok 6. Pečlivě zkontrolujte, zda jsou výsledky smíšené
Některé bakterie je obtížné přesně obarvit kvůli křehkosti nebo voskovité povaze jejich buněčných stěn. Tyto bakterie mohou vykazovat směs purpurové nebo růžové ve stejné buňce nebo mezi různými buňkami ve stejném nátěru. Bakteriální vzorky starší než 24 hodin mohou tento problém vykazovat, ale existují také některé bakteriální druhy, jejichž zbarvení je v jakémkoli věku odběru vzorků obtížné. Tyto bakterie vyžadují pro identifikaci specializovanější testy, jako je kyselé rychlé barvení, pozorování v bakteriální kultuře, kultivačním médiu TSI nebo genetické testování.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium a Propionibacterium spp. všechny jsou grampozitivní bakterie, ale často nejsou jasně obarveny.
- Malé, štíhlé bakterie, jako je Treponema, Chlamydia a Rickettsia spp. obtížně barvitelné Gramovou metodou.
Krok 7. Zlikvidujte veškerý zbývající spotřební materiál a vybavení
Tento postup likvidace odpadu se mezi laboratořemi liší a závisí na použitých materiálech. Obvykle je kapalina v barvicí misce likvidována v lahvích označených jako nebezpečný odpad. Sklíčka namočte do 10% roztoku bělidla a poté zlikvidujte v nádobě na ostré předměty.
Tipy
- Výsledky Gramova barvení budou dobré pouze tehdy, bude -li vzorek dobrý. Je důležité informovat pacienty, aby mohli poskytnout dobrý vzorek (např. Rozdíl mezi pliváním a hlubokým kašlem k získání vzorku sputa).
- Jako barevné bělidlo reaguje ethanol pomaleji než aceton.
- Pro zajištění bezpečnosti dodržujte standardní laboratorní předpisy.
- K procvičení použijte tampon na tvář, protože obsahuje grampozitivní i gramnegativní bakterie. Pokud vidíte pouze jeden druh bakterií, možná používáte příliš málo nebo příliš mnoho bělidla.
- K zajištění skluzavky můžete použít dřevěné spony.
Varování
- Aceton a ethanol jsou hořlavé látky. Aceton odstraní olej z vašich rukou, což pokožce usnadní vstřebávání dalších chemikálií. Noste rukavice a používejte je opatrně.
- Nenechte nátěr zaschnout, než smyjete Gramovu skvrnu nebo kontrastní barvivo.
Co potřebuješ
- Ukázka sítě
- Skleněná skluzavka
- Pipeta
- Malý zdroj ohně nebo posuvný ohřívač nebo methanol
- Voda
- Křišťálově fialová
- Jód
- Barevné bělidlo, jako je alkohol nebo aceton
- Safranin
